Synthesis, characterization, and biological evaluation of peptides capable of interfering with RANK-TRAF6 pathway using nuclear imaging

Tese de mestrado, Engenharia Biomédica e Biofísica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasThe RANK-RANKL interaction, and consequently, the RANK-TRAF6 pathway, is involved in several fundamental biological cycles, such as cell growth, apoptosis, osteosteoclastogenesis and inflammatory responses. As a result of partaking in such important processes, it is also implied that this pathway is related to severe pathologies, such as osteoporosis and breast or prostate cancer-induced bone metastasis. Currently, one of the therapeutic approaches to treat such diseases lies in the inhibition of RANK-RANKL interaction. Nonetheless, considerable interest arose in an alternative route, namely the inhibition of the RANK-TRAF6 pathway. This process is achievable, for example, by the interference of RANK’s interaction with TRAF6 using decoy peptides (e.g., L-T6DP-1). 8 Thus, the objective of this project was to synthesize, purify and biologically evaluate two peptides (3A and its negative control, 3B) containing a cell penetrating sequence (KLFMALVAFLRFLT), combined with sequences designed in silico to interfere with the RANK-TRAF6 pathway (RQMATADEA and RQMPTEDEY). Furthermore, biodistribution studies of peptides 3A and 3B, modified with a gallium-67 chelator were aimed to be achieved, in in vivo animal models, by micro-PET-SPECT-CT imaging. The aforementioned studies were not performed, as during the process, several issues arose. Some include long amino acid coupling times and difficulty radiolabeling peptide 3A. These adversities led to an overall unsuccessful procedure, requiring further optimization. Although the image acquisition of the synthesized peptides was impossible at this time, it was deemed that the equipment validation should still be made using an alternative compound that is currently being investigated by the C2TN-IST group: a 67Ga-radiolabeled gold nanoparticle named 67Ga-AuNP-BBN-Pt1.A interação RANK-RANKL, e consequentemente a via RANK-TRAF6, encontra-se envolvida em diversos ciclos biológicos fundamentais, tais como o crescimento celular, apoptose, osteoclastogénese, e respostas inflamatórias. No seguimento da interferência em tais processos, é implícito que a disrupção do normal funcionamento desta interação possa resultar em patologias severas, das quais se destacam osteoporose, ou, em casos mais extremos, metástases ósseas resultantes de cancro da mama ou da próstata. Considerem-se, por exemplo, pacientes diagnosticados com cancro da mama ou da próstata. As células tumorais deste tipo de cancros expressam fatores osteoclastogénicos capazes de alterar o microambiente do osso, como interleucinas(IL)-6 e IL-8, proteínas relacionadas com a hormona paratiroideia (PTHrP), fatores de necrose tumoral-α (TNF-α), entre outros. PTHrP e IL-11 induzem expressão de RANKL, enquanto suprimem a atividade do seu fator inibitório, a osteoprotegerina (OPG). Tal favorece a interação de RANKL com o seu recetor, RANK. A interação de RANK com o seu ligando, desencadeia uma cascata de eventos, que culmina com a ativação do fator nuclear kappa-β (NFkβ), um complexo proteico que regula mecanismos de resposta inflamatória, crescimento celular e apoptose. Dentro destes mecanismos, encontra-se a expressão genética osteoclástica e consequente osteoclatogénese que leva à reabsorção óssea. Encontramo-nos assim perante um loop de feedback positivo, no qual a alteração no microambiente do osso promove o crescimento de células cancerosas, que, por sua vez, promovem a expressão de RANKL e inibição da osteoprotegerina, desencadeando assim a via RANK-TRAF6, que ativa NF-κB, promovendo a expressão genética osteoclástica.16, 23-24 Atualmente, uma alternativa terapêutica para o tratamento de patologias que promovam degradação óssea (e.g. osteoporose) baseia-se na inibição da interação RANK-RANKL por ação do anticorpo monoclonal humano Denosumab. Este anticorpo mimetiza a função da osteoprotegerina (OPG), impedindo o RANKL de interagir com o seu recetor, RANK. Ao inibir a interação de RANK com RANKL, favorece-se o mecanismo de remodelação óssea. Apesar de ser uma terapia inovadora, a paragem na administração de Denosumab pode levar a uma reversão rápida da sua ação farmacológica, turnover, muitas vezes para níveis ainda mais críticos que os anteriores ao tratamento – também designado como ‘efeito rebound’.31 Não obstante, e tendo como inspiração o mecanismo de atuação do Denosumab, tem surgido um interesse crescente por vias alternativas. De entre as várias possibilidades, uma opção exequível passa pela inibição da via RANK-TRAF6. Este processo pode ser alcançado pela inibição da interação de RANKL com TRAF6, utilizando-se por exemplo decoy peptides (e.g., L-T6DP1). 8 Adicionalmente, considerando o nosso interesse no uso de péptidos como potenciais fármacos para terapia-alvo, ou como vetores de metalofármacos para várias aplicações biomédicas, o objetivo deste projeto contempla a síntese, purificação e avaliação biológica de um péptido (3A; KLFMALV AFLRFLTRQMPTEDEY-NH2) e o seu controlo negativo (3B; KLFMALVAFLRF LTRQMATADEANH2) que contêm uma sequência capaz de interferir com a interação proteína-proteína RANK-TRAF6 bem como sequências “penetradoras” (do inglês: cell penetrating sequence; KLFMALVAFLRFLT). Após a preparação dos péptidos 3A (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY-NH2) e 3B (KLFMAL VAFLRFLTRQMATADEA-NH2), o objetivo final do estudo consistia na obtenção de imagens SPECT da biodistribuição dos péptidos radioativos sintetizados em ratinhos saudáveis, pela técnica de imagiologia multimodal micro-PET-SPECT-CT. Numa fase inicial do projeto, experimentaram-se três tipos diferentes de síntese peptídica em fase sólida: (i) síntese ‘clássica’ (‘Classical’ SPPS); (ii) síntese com assistência de ultrassons (‘US-assisted SPPS’), e (iii) síntese com assistência de micro-ondas (‘MW-assisted SPPS’). Nesta fase, procedeu-se à síntese de um segmento do péptido 3B (S3B; RQMATADEA-NH2), com o objetivo de comparar os métodos de síntese peptídica em fase sólida ‘clássica’ e o mais recente método com auxílio a ultrassons. Ao finalizar a síntese pelos dois processos, verificou-se por análise RP-HPLC analítico que os rendimentos dos “resíduos brutos” eram de 84% para o método ‘clássico’, e 72% para o método com auxílio a ultrassons. Apesar de se ter obtido um menor rendimento de síntese, deve ser salientado que a síntese pelo método com auxílio de ultrassons foi finalizada em cerca de um quarto do tempo. Como tal, para a realização das sínteses subsequentes (dos péptidos 3A e 3B, e dos seus conjugados), escolheu-se o método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio de ultrassons. Para a síntese do péptido 3A (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY), foram realizadas duas tentativas: a primeira com um suporte polimérico MBHA Rink Amide, e a segunda com a resina NovaPEG Rink Amide. No primeiro procedimento (com MBHA Rink Amide), a síntese foi terminada. No entanto, após análise com RP-HPLC analítico (ver figura 4.4), verificou-se que mesmo que o péptido tivesse sido sintetizado, que o processo foi concluído com um rendimento muito baixo. Visando otimizar a síntese do péptido 3A, optou-se por utilizar, numa segunda instância, um novo suporte polimérico com um maior loading (LoadingMBHA= 0.38 mmol/g versus LoadingNovaPEG = 0.47 mmol/g). Durante a síntese com a nova resina, verificou-se que nos primeiros 12 aminoácidos os acoplamentos foram mais rápidos. Contudo, ao acoplar a segunda arginina do péptido (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY), decidiu-se dar como terminado o procedimento, dado que o tempo de acoplamento ultrapassava 8 h. Tendo chegado a um impasse, optou-se por realizar as sínteses dos péptidos 3A e 3B, consecutivamente, pelo método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio a micro-ondas. Por fim, os péptidos foram sintetizados por este método, com um rendimento moderado (53% para 3A, e 47% para 3B). Após purificação por RP-HPLC semi-preparativo, procedeu-se ao acoplamento do linker (PEG2) e do quelante bifuncional (NODAGA), seguindo o método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio a ultrassons. Subsequentemente, realizou-se a clivagem dos péptidos, purificação, e por fim, espectrofotometria UV-Vis para determinação de concentrações, em preparação para radiomarcação. Durante o procedimento de espectrofotometria UV-Vis, verificou-se que o péptido precipitava subitamente e frequentemente, a temperatura ambiente. O baixo rendimento da primeira síntese, e uma precipitação súbita a temperatura ambiente durante, levou a atribuir ao péptido 3A uma tendência a agregar, característica de péptidos com certas sequências. Apesar de não ter sido realizada uma análise detalhada a tal fenómeno, adotaram-se medidas preventivas, tal como a adição de uma pequena quantidade de ácido trifluoracético à solução durante UV-Vis, e realização da técnica flash freeze após cada utilização do péptido. A dificuldade em manusear o péptido 3A e o seu conjugado, tornou-se especialmente evidente durante a radiomarcação com 67Ga, a qual em condições standard se mostrou como uma impossibilidade. Devido a restrições de tempo, não foi possível realizar a otimização do processo de síntese dos péptidos 3A e 3B, bem como dos correspondentes conjugados, em quantidades suficientes para se fazerem estudos de otimização da radiomarcação. Como tal, tomou-se a decisão de suspender a utilização dos mesmos na fase final do projeto, até que as metodologias fossem revistas e otimizadas, processo esse que se encontra de momento a ser realizado. Para além deste trabalho experimental de síntese, procedeu-se paralelamente à validação do equipamento pré-clínico de imagem FLEXTM TriumphTM micro-PET-SPECT-CT, recentemente adquirido e instalado no C2TN-IST. O processo de validação envolveu duas fases, tendo-se iniciado com a utilização de diversos fantomas, tais como tubos de Eppendorf e seringas contendo soluções radioactivas. Este trabalho preparatório culminou numa segunda fase, na aquisição de uma imagem SPECT-CT de ratinhos com tumor (Balb/c com xenotransplantes celulares PC-3 de adenocarcinomas da próstata de origem humana) após administração localizada de nanopartículas radiomarcadas com 67Ga ( 67Ga-AuNP-BBN-Pt1). Os resultados das imagens pré-clínicas adquiridas (figuras 4.25 e 4.26) mostram uma diferença substancial na migração do composto 24 h p.i, que parece fixar-se durante um longo período (> 24 h) no tumor.O trabalho descrito nesta dissertação, teve como objetivo a síntese de um péptido e a sua conjugação a um agente quelante bifuncional, visando a sua marcação radioativa com 67Ga e posterior avaliação da sua biodistribuição em ratinhos por imagiologia pré-clínica multimodal FLEXTM TriumphTM microPET-SPECT-CT. Em simultâneo, pretendeu-se validar e calibrar o equipamento pré-clínico multimodal micro-PET-SPECT-CT recentemente adquirido pelo C 2TN-IST. Uma vez que não foi possível a aquisição de imagens nucleares com radiopéptidos inicialmente propostos, em alternativa, e após validação do equipamento, fez-se um estudo imagiológico de nanopartículas radiomarcadas com 67Ga ( 67Ga-AuNP-BBN-Pt1), em ratinhos Balb/c com xenotransplantes celulares PC-3 de adenocarcinomas da próstata de origem humana. Em conclusão, pode dizer-se que o trabalho experimental realizado contemplou a utilização de inúmeras diferentes técnicas e metodologias, englobando diversos métodos de síntese peptídica em fase sólida, purificação, técnicas de radiomarcação e muito mais. Adicionalmente, foram também realizadas aquisições e tratamentos de imagens multimodais SPECT-CT de modelos animais. Esta abrangência permitiu ao mestrando tomar contacto com muitos aspetos essenciais da Medicina Nuclear, mais especificamente com os relacionados com a radioquímica farmacêutica e equipamento de imagiologia pré-clínica

Geoeconomic variations in epidemiology, ventilation management, and outcomes in invasively ventilated intensive care unit patients without acute respiratory distress syndrome: a pooled analysis of four observational studies

Background: Geoeconomic variations in epidemiology, the practice of ventilation, and outcome in invasively ventilated intensive care unit (ICU) patients without acute respiratory distress syndrome (ARDS) remain unexplored. In this analysis we aim to address these gaps using individual patient data of four large observational studies. Methods: In this pooled analysis we harmonised individual patient data from the ERICC, LUNG SAFE, PRoVENT, and PRoVENT-iMiC prospective observational studies, which were conducted from June, 2011, to December, 2018, in 534 ICUs in 54 countries. We used the 2016 World Bank classification to define two geoeconomic regions: middle-income countries (MICs) and high-income countries (HICs). ARDS was defined according to the Berlin criteria. Descriptive statistics were used to compare patients in MICs versus HICs. The primary outcome was the use of low tidal volume ventilation (LTVV) for the first 3 days of mechanical ventilation. Secondary outcomes were key ventilation parameters (tidal volume size, positive end-expiratory pressure, fraction of inspired oxygen, peak pressure, plateau pressure, driving pressure, and respiratory rate), patient characteristics, the risk for and actual development of acute respiratory distress syndrome after the first day of ventilation, duration of ventilation, ICU length of stay, and ICU mortality. Findings: Of the 7608 patients included in the original studies, this analysis included 3852 patients without ARDS, of whom 2345 were from MICs and 1507 were from HICs. Patients in MICs were younger, shorter and with a slightly lower body-mass index, more often had diabetes and active cancer, but less often chronic obstructive pulmonary disease and heart failure than patients from HICs. Sequential organ failure assessment scores were similar in MICs and HICs. Use of LTVV in MICs and HICs was comparable (42·4% vs 44·2%; absolute difference -1·69 [-9·58 to 6·11] p=0·67; data available in 3174 [82%] of 3852 patients). The median applied positive end expiratory pressure was lower in MICs than in HICs (5 [IQR 5-8] vs 6 [5-8] cm H2O; p=0·0011). ICU mortality was higher in MICs than in HICs (30·5% vs 19·9%; p=0·0004; adjusted effect 16·41% [95% CI 9·52-23·52]; p<0·0001) and was inversely associated with gross domestic product (adjusted odds ratio for a US$10 000 increase per capita 0·80 [95% CI 0·75-0·86]; p<0·0001). Interpretation: Despite similar disease severity and ventilation management, ICU mortality in patients without ARDS is higher in MICs than in HICs, with a strong association with country-level economic status

ISARIC-COVID-19 dataset: A Prospective, Standardized, Global Dataset of Patients Hospitalized with COVID-19

The International Severe Acute Respiratory and Emerging Infection Consortium (ISARIC) COVID-19 dataset is one of the largest international databases of prospectively collected clinical data on people hospitalized with COVID-19. This dataset was compiled during the COVID-19 pandemic by a network of hospitals that collect data using the ISARIC-World Health Organization Clinical Characterization Protocol and data tools. The database includes data from more than 705,000 patients, collected in more than 60 countries and 1,500 centres worldwide. Patient data are available from acute hospital admissions with COVID-19 and outpatient follow-ups. The data include signs and symptoms, pre-existing comorbidities, vital signs, chronic and acute treatments, complications, dates of hospitalization and discharge, mortality, viral strains, vaccination status, and other data. Here, we present the dataset characteristics, explain its architecture and how to gain access, and provide tools to facilitate its use

Characteristics and outcomes of an international cohort of 600 000 hospitalized patients with COVID-19

Background: We describe demographic features, treatments and clinical outcomes in the International Severe Acute Respiratory and emerging Infection Consortium (ISARIC) COVID-19 cohort, one of the world's largest international, standardized data sets concerning hospitalized patients. Methods: The data set analysed includes COVID-19 patients hospitalized between January 2020 and January 2022 in 52 countries. We investigated how symptoms on admission, co-morbidities, risk factors and treatments varied by age, sex and other characteristics. We used Cox regression models to investigate associations between demographics, symptoms, co-morbidities and other factors with risk of death, admission to an intensive care unit (ICU) and invasive mechanical ventilation (IMV). Results: Data were available for 689 572 patients with laboratory-confirmed (91.1%) or clinically diagnosed (8.9%) SARS-CoV-2 infection from 52 countries. Age [adjusted hazard ratio per 10 years 1.49 (95% CI 1.48, 1.49)] and male sex [1.23 (1.21, 1.24)] were associated with a higher risk of death. Rates of admission to an ICU and use of IMV increased with age up to age 60 years then dropped. Symptoms, co-morbidities and treatments varied by age and had varied associations with clinical outcomes. The case-fatality ratio varied by country partly due to differences in the clinical characteristics of recruited patients and was on average 21.5%. Conclusions: Age was the strongest determinant of risk of death, with a ∼30-fold difference between the oldest and youngest groups; each of the co-morbidities included was associated with up to an almost 2-fold increase in risk. Smoking and obesity were also associated with a higher risk of death. The size of our international database and the standardized data collection method make this study a comprehensive international description of COVID-19 clinical features. Our findings may inform strategies that involve prioritization of patients hospitalized with COVID-19 who have a higher risk of death